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            什么是空間轉錄組測序

            空間轉錄組學(Spatial Transcriptomics)是指在組織切片上完成,保留樣本空間信息的組學研究。空間轉錄組可展示組織切片中不同區域的基因表達情況,揭示精細病理區域中激活的信號通路,完成分子特征驅動病理特征的機制解析。空間轉錄組學完成了病理數字化結合病理影像化的技術革新,對于診斷標志物、耐藥位點以及靶向藥物的研發,免疫治療等新興領域都具有重要作用。

            設計原理 檢測通量 空間信息保留 實驗成本 代表性技術


            空間轉錄組

            Spatial barcode標記空間信息

            烈冰的空間轉錄組技術

            較低

            部分
            僅顯示切取部位在組織中的空間信息,無細胞內部空間結構

            LCM-seq

            顯微鏡下切取待檢測組織

            LCM-seq、Neo-seq

            需激光共聚焦顯微鏡,需經驗豐富人員進行顯微切割操作


            FISH-seq

            抗體識別,熒光標記

            MERFISH、Seq-FISH

            受熒光檢測通道限制

            針對基因設計探針,需激光共聚焦顯微鏡,需反復雜交和圖像讀取

            部分
            僅顯示切取部位在組織中的空間信息,無細胞內部空間結構

            流式分選

            選取特定細胞,需要特異性抗體對細胞進行分選

            FACS, INTACT

            較低

            Visium空間轉錄組學的原理

            當組織冷凍切片附在帶有spatial barcode的空間轉錄組芯片上時,通過透化處理,細胞內的mRNA釋放出來,從而被芯片上帶有oligo-dT的探針捕獲。被捕獲的mRNA開始逆轉錄,得到的cDNA中包含了spatial barcode序列。通過上機測序,可以將每個mRNA轉錄的序列映射回組織切片中的映射回組織切片中的原始位置。

            Visium空間轉錄組的核心在于芯片部分:
            • 正式文庫構建的芯片上有4個捕獲區域(6.5mm X 6.5mm,可以檢測4個樣本)
            • 每個捕獲區域含有約5000個被條形碼標記的點(barcoded spots)
            • 每個spot直徑55μm,每個spot能捕獲1-10個細胞
            • spot與spot中心點之間的距離為100μm
            • 每個spot含有上百萬個可以與mRNA結合的捕獲探針,每個探針上都帶有獨特的spatial barcodes,用以標記捕獲的mRNA的空間位置


            4個

            捕獲區域

            4個

            樣本

            ~5000個

            條形碼標記點

            55μm

            sport直徑

            100μm

            點距

            技術難點和烈冰解決方案

            無冷凍切片條件可以進行空間轉錄組測序嗎?

            01

            烈冰提供空間轉錄組全流程服務,包括樣本包埋、貼片、選片、HE染色、拍照成像、組織透化、建庫測序以及后續的FISH驗證等各個步驟,為您提供無憂服務。

            冷凍切片質量可否保證?

            02

            烈冰搭建了以萊卡CM1950冷凍切片機、尼康多熒光通路全自動掃描顯微鏡、3Dhistech-midi數字掃描儀為基礎的先進實驗平臺,并制定嚴格規范的實驗室SOP,經過大量的切片、貼片實操演練,對不同類型組織的切片厚度、溫度進行優化,確保獲得最優質量的冷凍切片。

            空間轉錄組測序數據量大,分析困難怎么辦?

            03

            利用NovelBrain云分析平臺,搭建0代碼需求的空間轉錄組分析流程,準確快速解析空間轉錄組數據。 

            空間區域內細胞類型如何判定?

            04

            取同一樣本組織的相鄰區域進行單細胞轉錄組測序,通過單細胞轉錄組數據和空間轉錄組數據的整合分析,判定空間區域內的細胞類別,精確解析組織空間內的異質化信息。

            空間轉錄組測序的應用領域

            病理學

            通過添加基因表達維度,得出形態學結論;

            通過觀察基因表達區域,了解可能發生假陰性/假陽性的位置

            腫瘤學

            腫瘤微環境及腫瘤異質性,研究空間位置上腫瘤組織與癌旁、正常組織基因表達的區別;

            腫瘤發生發展、浸潤、轉移等不同階段腫瘤細胞的變化對正常細胞的影響

            免疫學

            免疫細胞浸潤、不同區域的免疫細胞中的基因表達特征;

            免疫群體擴散、不同類型免疫細胞的空間位置解析

            神經科學

            大腦皮層層狀組織解析,揭示大腦皮層的結構-功能關系;

            正常vs.疾病大腦結構特征分析與疾病相關的基因表達于特定的大腦皮層

            發育生物學

            通過解析每個發育階段不同解剖區域特有的基因表達特征,解析組織中與形態形成相關基因;

            豐富基因表達的空間注釋信息,創建組織發育的空間細胞圖譜

            空間轉錄組優勢

            01      

            提供實驗操作更精細的冷凍解決方案

            - 烈冰配置了LEICA?CM1950冷凍切片機,搭配切片經驗豐富的實驗團隊,可以提供一致性更高、實驗操作更精細的冷凍切片準備方案

            - 保持密切高效的溝通,設計更適合的實驗方案,確保每一個實驗細節有效進行



            02      

            高清明場和熒光場拍攝成像解決方案

            - 烈冰升級配置尼康相差顯微鏡和CCD成像系統,更高清分辨率解析組織切片原始圖像信息

            - 10X,20X,40X,60X更多物鏡選擇,為不同大小的樣本提供更清晰的圖像

            - 更精細的圖像信息采集、拼接策略,為樣本內微小區域的組織學提供更清晰的影像


            03      

            烈冰NovelBrain云分析平臺

            - 解決空間轉錄組測序數據分析中由于超大數據量、超高的質控要求以及繁多分析需求而引起的分析困難

            - 做到快速可定制化完成空間轉錄組分析



            04      

            提供免疫組化(Immunohistochemistry)和熒光原位雜交(FISH)服務

            - 擁有行業先進的3DHISTECH公司的PANNORAMIC系列的數字切片掃描儀,可以同時實現明場與熒光場下冷凍切片的快速掃描成像;

            - Z-Stack多層聚焦掃描及Extended Focus 景深擴展多層融合掃描模式,進一步提升分辨率和清晰度,保證切片高分辨的數字圖像信息精準采集;

            - 能夠滿足針對分析結果中感興趣基因的RNA-FISH驗證以及組織切片的免疫組化的高清成像,獲取表達與定位信息。

            05      

            定制化一站式服務

            - 烈冰生物真正實現空間轉錄組測序的全程把控,做到從實驗設計、空間信息標記、建庫測序、定制化分析的全流程一站式服務,助力高分文章發表

            - 資深的實驗團隊保證樣本的高度一致性;專業的生物學團隊提供個性化的產品應用場景解讀、保持對生物學意義的關注;強大的生信分析團隊一對一地進行詳實科學的實驗方案設計并提供多次售后分析



            實驗流程


            第1步
            客戶樣本

            第2步
            冷凍切片

            第3步
            HE染色、拍照成像

            第4步
            透化、反轉

            第5步
            文庫構建

            第6步
            上機測序

            樣本要求

            數據分析流程


            可接受樣品類別

            • 冰凍組織:新鮮樣本經液氮預冷的異戊烷速凍,-80℃保存
            • OCT包埋組織:新鮮組織異戊烷速凍后進行OCT包埋,或新鮮組織直接OCT包埋后-80℃速凍,注意標明樣本方向,樣本于-80℃保存

            樣本處理和運輸過程需要在低溫環境



            結果展示

            點陣亞群分析

            基于每個點陣的基因表達量,采用聚類算法對細胞進行亞群分析,同時采用t-SNE分析對各點陣的空間排布進行可視化展示

            解剖區域細分

            以每個點陣中的表達量數據為研究對象,根據指定的解剖區域(臨近切片或者當前切片)進行結果展示,包括基因區域的集中展示

            點陣簇Marker基因分析

            可視化展示不同點陣亞群中Marker基因的表達分布:Aldoc星狀膠質;GAdl抑制性神經元;Mbp少突膠質細胞;Slc17a6興奮性神經元

            信號通路富集分析

            采用個性化分析策略,在研究者關注的點陣、區域、樣本中分析研究者關注的基因集

            細胞通訊分析

            采用Cellphone算法,針對不同點陣亞群cluster之間或內部的Ligand-Receptor關系進行分析,展示了微環境中跨細胞類型的通訊關系,幫助解析微環境的形成機制和調控機理

            文獻案例

            空間轉錄組和單細胞數據整合分析揭示胰腺癌的組織構造

            發表時間:2020年1月

            發表期刊:Nature Biotechonolgy

            影響因子:31.864

            發表單位:NYU Langone Health


            研究背景:在發育過程或疾病發生過程中,組織內部的不同細胞經歷了復雜的生物學過程,因此,組織內部的異質性研究是目前揭示重要生物學研究的一個重要研究手段。組織內部的異質性包括細胞類型的異質性和空間位置的異質性兩個層面,細胞類型異質性可由單細胞測序來完美呈現,而空間位置的異質性,則需要可高通量地檢測全轉錄組空間信息的新型研究方法來解決


            研究方法:空間轉錄組測序,獲得組織內部精確空間范圍內的全基因表達譜,解析空間異質性。


            研究結果:

            首先將兩例新鮮胰腺癌組織同時進行單細胞測序和空間轉錄組測序分析。以PDAC-A為例,單細胞測序鑒定到15個細胞類群。空間轉錄組測序獲得了以點陣為單位的全轉錄組信息,根據marker基因的表達情況,將組織切片分為腫瘤區域,胰腺區域,導管上皮區域和基質區域。隨后,針對單細胞測序和空間轉錄組測序得到的特異高表達的基因進行整合分析,得到特定區域的細胞類群組成情況。比如,導管上皮區域主要由導管細胞組成。


            對導管細胞細分為四個亞群:缺氧區域導管、腺泡中心導管、尾端導管和抗原遞呈導管。并用各個亞群的marker基因與空間轉錄組數據進行聯合分析。發現缺氧導管和尾端導管在腫瘤區域富集。腫瘤組織的缺氧環境可能導致腫瘤區域的導管細胞內缺氧相關基因的表達。


            【1】Spatiotemporal dynamics of molecular pathology in amyotrophiclateral sclerosis

            發表時間:201904;發表期刊:Science;影響因子:41.037;物種:人、小鼠;組織:腰椎脊髓組織

            【2】A Spatiotemporal Organ-Wide Gene Expression and Cell Atlas of the Developing Human Heart

            發表時間:201912;發表期刊:Cell;影響因子:36.216;物種:人;組織:胚胎心臟

            【3】Repopulating Microglia Promote Brain Repair in an IL-6-Dependent Manner

            發表時間:202003;發表期刊:cell;影響因子:36.216;物種:小鼠;組織:大腦小膠質細胞

            【4】Integrating microarray-based spatial transcriptomics and single-cell RNA-seq reveals tissue architecture in pancreatic ductal adenocarcinomas

            發表時間:202001;發表期刊:Nature Biotechnology;影響因子:31.864;物種:人;組織:胰腺

            【5】Combined single-cell and spatial transcriptomics reveal the molecular, cellular and spatial bone marrow niche organization

            發表時間:202001;發表期刊:Nature Cell Biology;影響因子:17.428;物種:小鼠;組織:骨髓

            【6】Spatially resolved transcriptome profiling in model plant species

            發表時間:201705;發表期刊:NaturePlants;影響因子:13.297;物種:模式植物-擬南芥、楊樹、云杉;組織:

            【7】Spatial maps of prostate cancer transcriptomes reveal an unexplored landscape of heterogeneity

            發表時間:201806;發表期刊:Nature Communication;影響因子:11.878;物種:人;組織:前列腺

            【8】Spatially Resolved Transcriptomics Enables Dissection of Genetic Heterogeneity in Stage III Cutaneous Malignant Melanoma

            發表時間:201810;發表期刊:Cancer Research;影響因子:8.378;物種:人;組織:皮膚

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