DNA甲基化(DNA methylation)是基因調控的手段之一,在維持細胞正常功能、傳遞基因組印記、胚胎發育、腫瘤發生等方面起著至關重要的作用,更是表觀遺傳學研究的熱點。全基因組甲基化測序(Whole Genome Bisulfite Sequencing,WGBS)作為甲基化測序的“金標準”,對有參考基因組的物種在全基因組水平進行全面、高效、高準確度的甲基化研究,從而構建單堿基分辨率的全基因組DNA甲基化水平圖譜。
哺乳動物DNA甲基化主要為CG型,而富含CpG二核苷酸的CpG島常位于轉錄調控區附近,與56%的人類基因組編碼基因相關。上海烈冰與Agilent公司聯手推出的CpG島精準甲基化測序,采用SureSelect系統進行靶標富集,全面覆蓋基因組中最具表觀遺傳學研究意義的區域,極大提高測序數據有效性,達到單堿基分辨率,同時降低成本,縮短測序時長,實現多樣本實驗。
A workflow for Bisulfite Sequencing
1. 精準覆蓋:采用SureSelect靶標富集系統,可覆蓋370萬CpG,包括CpG島、GENCODE啟動子、癌癥以及組織特異性DMR等,對具有生物學意義的甲基化位點實現全面覆蓋;
2. 高深度:只需10Gb數據可達100×覆蓋深度,是普通測序深度的3倍,極大提高了對低頻甲基化位點的探測率;
3. 高靈敏度:采用Bisulfite轉化前捕獲,對甲基化和非甲基化均等捕獲;單堿基分辨率,可精準檢測每個胞嘧啶的甲基化狀態;
4. 低成本、高效率:使用液體捕獲技術,大大提高捕獲效率;同時靶標區域的選擇策略可降低成本,得以實現多樣本快速實驗;
組織樣品≥50mg
DNA樣品
1. 請提供總量≥3μg/樣本,濃度≥100ng/μL的DNA;
2. OD260/280介于1.8-2.0之間;
3. 電泳檢測無明顯RNA污染,基因組條帶清晰、完整,無降解;
4. 送樣時請標記清楚樣品編號,管口使用Parafilm膜密封;
5. 樣品保存期間切忌反復凍融;
6. 送樣時請使用干冰運輸。
注:不同樣品之間存在差異,詳情請向烈冰咨詢
1. DNA提取及質控:凝膠電泳質控→Nanodrop質控→Agilent 2200質控;
2. DNA超聲片段化:片段化后,末端修復加A,并連接甲基化接頭;
3. SureSelect靶向捕獲:單鏈RNA探針雜交進行液相捕獲;
4. Bisulfite轉化:靶向捕獲之后進行BS轉化,降低甲基化偏好性和DNA損傷;
5. 加接頭擴增:捕獲之后進行PCR擴增文庫構建,降低PCR偏好性;
6. 上機測序:烈冰建議選擇NovaSeq,雙端測序,通量大,堿基精度高,而且成本低,速度快。數據量:10G。
堿基質量結果圖
注:左圖橫坐標代表堿基位點,縱坐標代表堿基質量值,不同顏色曲線代表不同堿基在每條read上的質量值;右圖橫坐標代表堿基位點,縱坐標代表堿基含量比值,不同顏色曲線代表不同位點各堿基含量。
比對流程
注:該圖為Bismark比對原理圖
CpG位點在基因組上的分布
Li J et al., Genome Research. 2019
注:該圖對比了GPS和WGBS檢測出的CpG位點在基因組上的分布情況
多樣本間甲基化相關性分析
Wan et al., Sci Rep. 2016
注:該圖展示了羅非魚骨骼肌雌雄兩性間CpG甲基化的Pearson相關性
CIRCOS:差異甲基化區域
Yizan Ma et al., Plant Cell. 2018
注:通過繪制可視化Circos圖,展示了常溫(NT)和高溫(HT)處理對不同品系棉花(84021和H05)花藥不同時期DMR在染色體上的分布情況
DMR相關基因群PPI分析
注:基于DMS/DMR注釋基因的GO條目和Pathway條目,我們可以根據其上下級調控關系繪制GO-Tree和Pathway-Act-Network,并基于STRING數據庫進行PPI分析
不同樣本CG-DMR的基因組分布
Rizzardi LF et al., Nat Neurosci. 2019
注:該圖通過聚類分析展示了不同Cell type和neuronal中的CG-DMR在基因組結構上的分布情況
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